復旦大學于敏教授課題組《AJPS》：高精度3D打印用于抗凝藥物重組水蛭素 (r-hirudin) 新型微創無痛遞藥系統的設計制備

抗凝治療通常被用作心腦血管疾病治療的首.選策略，且此類患者大多需要長期甚至終身服用抗凝藥物。直接口服抗凝劑有導致胃腸道出血的風險，尤其是對于有胃腸道疾病如胃腸道潰瘍的患者，這種出血是致命的。皮下或靜脈注射給藥或可規避胃腸道出血的風險，但是注射給藥需專業人員輔助，這對長期用藥的患者而言極其不便，注射引起的疼痛亦會導致患者用藥依從性較差。此外，皮下注射抗凝劑還會導致皮下出血淤青，增加感染風險，給抗凝藥物臨床應用帶來了很的不便。透皮給藥作為一種前瞻性給藥策略，可以補充注射和口服給藥的局限性 (圖1)。
 

圖1. 臨床抗凝藥物給藥方式及不良反應

微針 (Microneedle，MN) 作為微米級的微創設備，可通過破壞皮膚最外層角質層產生短暫的疏水性毛孔，將治療藥物輸送至表皮中，被認為是最有前途的透皮給藥系統之一。目前，微針的制備主要通過微模型澆鑄法，但是用于微模型制備的方法大多局限于光刻或者化學蝕刻，工藝復雜、周期長且成本高，限制了微針的多樣性和個性化發展。高精度 3D 打印是近年來新興的一種微模型制備方法，由于該法簡單高效且成本相對較低，已廣泛應用于生物醫藥的各領域，為微針陣列模型的設計制備提供了新的選擇。

圖2.微針陣列模型的設計與打印 A. 1#微針陣列模型的計算機模擬(左)、打印預覽(中)及3D 打印微針的長度(右)；B.2#微針陣列模型的計算機模擬(左)、打印預覽(中)及3D 打印微針的長度(右)；C.設計模型和打印模型對比

近期，復旦大學代謝分子醫學教育部重點實驗室于敏教授團隊聯合復旦大學藥學院沈騰老師提出了一種基于 3D 打印技術的微模型制備方法。該團隊利用新型超高精度 3D 打印技術 (nano Arch P140，摩方精密) 實現了個性化設計的微針陣列模型的制備，并通過開發一條新的模型復刻工藝成功制備了基于 3D 打印模型的微針模具，最終制備了 r-hirudin 新型微創無痛遞藥系統。該方法成功解決了以光敏樹脂為打印材料的微針陣列表面 PDMS 無法固化導致的模型翻制問題，同時進一步拓展了 3D 打印在微針陣列設計制備領域的應用。利用高精度 3D 打印制備的微針陣列擁有較高的分辨率，打印的微針形貌特征保留完整、尺寸均一，為載藥微針的定性與定量分析奠定了基礎。相關成果以“Design and fabrication of r-hirudin loaded dissolving microneedle patch for minimally invasive and long-term treatment of thromboembolic disease” 為題發表在《Asian Journal of Pharmaceutical Sciences》期刊上。

在該研究中，首先利用計算機輔助的模型設計對目標微針陣列進行設計優化，分別按需設計了兩款不同參數的微針陣列模型，如圖 2A所示，考慮到 3D 打印分辨率的限制，繪制微針長度為 1000 μm，允許微針有 100-200 μm 的長度損失，設置微針形狀為五棱錐形，底邊長度分別為 150 μm 和 100 μm，將微針有序排列成 10 × 10 的微針陣列 (圖 2B)。將設計圖紙輸出導入 3D 打印軟件進行打印，最終獲得基于光敏樹脂的微針陣列模型。與設計模型相比，微針的高度發生了100-200μm 的損失 ，但在允許范圍之內，微針針體形貌保存完整，不同微針個體尺寸均一 (圖 2C)，提示高精度 3D 打印在微針陣列模型制備方面具有巨大的應用潛力。

圖3.微針模具及 3DMN 制備流程圖

由于以光敏樹脂為打印材料的微針陣列模型在用 PDMS 進行模型翻制時在接觸表面 PDMS 無法固化，所以選擇明膠作為中間過渡材料替代直接使用 PDMS 進行微針模具制備，開發一條新的模型制備工藝(圖 3)，并通過該路線成功制備了微針制備模具。將該模具應用于r-hirudin 遞藥系統的制備，通過連續的微模型澆鑄并輔以恒溫真空制備r-hirudin 荷載的 3DMN。對 3DMN 進行表征分析并在實驗動物體內進行微針給藥的藥效學與藥物代謝動力學分析，結果顯示 3DMN 給藥可以實現快速的透皮藥物遞送，血藥濃度在給藥后 0.5 h 達到峰值 (圖 4D-F)，血液的凝固時間在 3DMN 給藥后顯著延長 (圖 4A-C)。對 3DMN 給藥的生物利用度(BA) 進行分析，發現 3DMN 給藥相對于皮下注射給藥的BA可達50% (圖 4G-F)。該結果初步驗證了基于高精度 3D 打印的微針陣列模型制備的 3DMN 在介導透皮 r-hirudin 遞送中的可行性。

圖4. 3DMN 介導的r-hirudin 透皮遞送的體內藥效學與藥物代謝動力學研究 A-C. 血液凝固時間隨給藥時間的變化；D-F. 血清 r-hirudin 濃度隨時間變化曲線；F. 不同給藥方式血清藥物濃度隨時間變化曲線 G. 不同給藥方式血清藥物濃度參數

進一步研究 3DMN 在血栓性疾病防治中的應用，分別構建腎上腺素/Ⅰ型膠原混合物尾靜脈注射誘導的急性肺栓塞動物模型和三氯化鐵損傷誘導的腸系膜微動脈血栓動物模型，將載藥 3DMN 用于動靜脈血栓的預防性治療，研究發現

3DMN 介導的r-hirudin 用藥可以顯著抑制急性肺栓塞模型小鼠肺部血管栓塞的形成 (圖 5C-D)，提高小鼠的存活率 (圖 5A-B)。此外還觀察到，3DMN 介導的 r-hirudin 用藥同樣可以顯著三氯化鐵損傷誘導的腸系膜動脈血栓的形成，降低血栓發生率 (圖 6)。以上結果進一步說明 3DMN 可用于動靜脈血栓的預防性用藥，而高精度 3D 打印技術的出現不僅豐富了微針多樣性，也為未來臨床用藥個體微針量身定制提供了基礎，具有很大的經濟效益與社會效益。

圖5. 3DMN 在預防急性肺栓塞中的應用A-B. 3DMN 給藥對急性肺栓塞小鼠生存率的影響；C. 小鼠肺部組織石蠟切片 HE 染色；D. 小鼠肺部 CT 掃描圖

圖 6. 3DMN 在預防腸系膜微動脈血栓中的應用 A. 血小板在血管損傷部位聚集的體內成像；B. 血栓形成率的統計分析圖；C. 血栓形成長度統計分析圖