傷口感染是指傷口在愈合過程中仍被細(xì)菌或其他微生物感染的疾病。與急性傷口不同，慢性感染性傷口通常經(jīng)歷較長時間的愈合過程或無法愈合，給患者帶來了嚴(yán)重的后果和沉重的負(fù)擔(dān)。傳統(tǒng)上，感染傷口的治療方法主要包括定期傷口清創(chuàng)、口服抗生素、抗菌敷料等。但是這些方法都有一定的局限，首先，細(xì)菌在傷口部位產(chǎn)生的生物膜形成物理屏障，限制抗菌劑或生物大分子滲透到深部組織，從而顯著降低藥物遞送效率；其次，抗生素的誤用和過度使用是增加抗生素耐藥性風(fēng)險(xiǎn)的主要驅(qū)動因素，抗生素耐藥性已成為嚴(yán)重的全球健康問題；此外，頻繁更換敷料，可能會導(dǎo)致傷口疼痛和繼發(fā)性損傷，從而顯著降低患者的依從性。因此，非常需要研發(fā)一種新的傷口愈合治療策略。

基于此，武漢大學(xué)藥學(xué)院黎威教授團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)開發(fā)了一種具有長效抗菌效果的活性益生菌微針貼片，用于治療慢性感染傷口。該微針貼片是利用摩方精密 microArch® S240 （精度：10μm）3D打印設(shè)備加工模具后經(jīng)PDMS翻模制備而成，相關(guān)研究成果以“Accelerated infected wound healing by probiotic-based living microneedles with long-acting antibacterial effect"為題發(fā)表在期刊《Bioactive Materials》上。武漢大學(xué)藥學(xué)院碩士研究生靳銀麗、武漢大學(xué)中南醫(yī)院藥劑科盧云、武漢大學(xué)藥學(xué)院博士研究生江雪為共同第一作者，武漢大學(xué)藥學(xué)院黎威教授、武漢大學(xué)中南醫(yī)院整形美容科郭亮主任醫(yī)師為共同通訊作者。

該微針貼片（5% GL MN）由聚乙烯醇（PVA）、蔗糖、5%甘油和羅伊氏乳桿菌制成。其中，PVA-蔗糖基質(zhì)為5% GL MN提供足夠的機(jī)械強(qiáng)度，促進(jìn)5% GL MN在插入皮膚后快速溶解，從而實(shí)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌的快速遞送；羅伊氏乳桿菌可以代謝甘油產(chǎn)生具有抗菌作用的羅氏菌素，從而在慢性感染傷口處實(shí)現(xiàn)抗菌、減少炎癥、促進(jìn)傷口愈合的作用。值得注意的是，在5% GL MN中加入的甘油不僅不影響羅伊氏乳桿菌的存活，而且還為羅伊氏乳桿菌持續(xù)產(chǎn)生羅氏菌素提供了充分來源，從而在傷口深處實(shí)現(xiàn)長效抗菌和抗炎作用。

圖1.用于慢性感染傷口愈合的5% GL MN示意圖。（a）含有羅伊氏乳桿菌的5% GL MN示意圖。（b）羅伊氏乳桿菌具有抗菌和抗炎作用的工作機(jī)理。（c）5% GL MN具有長效抗菌作用，可加速感染傷口愈合。

首先采用真空輔助微成型方法制備GL MNs 貼片，并對微針的形貌、機(jī)械強(qiáng)度、穿刺皮膚的能力、溶解速度以及釋藥效率等進(jìn)行一系列表征。

圖2. GL MNs貼片的制造和表征。（a）GL MNs貼片的制作過程示意圖。（b）具有不同甘油濃度的GL MNs 貼片的代表性明場顯微鏡圖像。（c）分別含有0%、2.5 %和5 %甘油的GL MNs 貼片的力-位移曲線。（d）GL MNs 貼片插入豬皮膚后的代表性明場和熒光顯微鏡圖像。（e）施用GL MNs貼片后豬皮膚的組織學(xué)切片圖像。（f）GL MNs貼片施用于豬皮膚后不同時間的代表性明場顯微鏡圖像。（g）施用于豬皮后殘留微針長度的定量分析。（h）GL MNs 貼片在PBS中的累積藥物釋放。每個點(diǎn)代表平均值±SD（n = 3），***P < 0.001。

制備的GL MNs 貼片結(jié)構(gòu)為基底半徑200 μm，高度850 μm，尖部半徑～10 μm的錐形，微針排列成10×10陣列，面積為7 mm×7 mm。羅伊氏乳桿菌以良好的形態(tài)封裝在微針內(nèi)。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）結(jié)果顯示，羅伊氏乳桿菌產(chǎn)生的物質(zhì)中存在與3-羥基丙醛（3-HPA）相對應(yīng)的分子離子峰（M=74.0607），這表明羅伊氏乳桿菌具有產(chǎn)生抗菌物質(zhì)羅氏菌素的能力。定量分析表明，5 % GL MNs 中的羅伊氏乳桿菌能產(chǎn)生更多的羅氏菌素。而羅氏菌素可以引起大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞桿菌的顯著形態(tài)變化，據(jù)推測，羅氏菌素通過抑制細(xì)菌核糖核苷酸還原酶的活性，而核糖核苷酸還原酶對DNA合成至關(guān)重要，從而實(shí)現(xiàn)廣譜抗菌活性。

圖3. 5% GL MN 貼片的表征和羅氏菌素的抗菌作用。（a）5% GL MN 貼片（b）5% GL MN貼片單根針的橫截面和（c）從5% GL MN 貼片中提取的羅伊氏乳桿菌的FESEM圖像，（b）中的黃色箭頭表示微針中存在羅伊氏乳桿菌。（d）對5% GL MN 貼片中羅伊氏乳桿菌產(chǎn)生的羅氏菌素的LC-MS分析。（e）含有不同濃度甘油的GL MNs貼片產(chǎn)生羅氏菌素的定量分析。（f）大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞桿菌用羅氏菌素治療后形態(tài)的代表性FESEM圖像。每個點(diǎn)表示平均值± SD（n = 3），*P < 0.05，***P < 0.001。

隨后，為了進(jìn)一步評估5% GL MN貼片的抗菌效果，通過細(xì)菌的活死染色實(shí)驗(yàn)、平板涂布和抑菌圈實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證5% GL MN貼片具有良好的抗菌效果。此外，5 % GL MN貼片在體外也顯示出有效的金黃色葡萄球菌生物膜清除率，這通常在有害細(xì)菌的耐藥性中起關(guān)鍵作用。

圖4. 5% GL MN貼片在體外的抗菌作用。（a）金黃色葡萄球菌與GL MNs貼片孵育24小時后的活/死測定。（b）GL MNs貼片處理后大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞桿菌的細(xì)菌死亡率。（c） LB瓊脂平板的代表性明場圖像，顯示大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞桿菌在與不同GL MNs貼片孵育24小時后的生長情況。（d）接受不同GL MNs貼片處理24小時后LB液體培養(yǎng)基中大腸桿菌，金黃色葡萄球菌或銅綠假單胞桿菌的OD600值。（e）不同GL MNs貼片處理24小時對大腸桿菌，金黃色葡萄球菌或銅綠假單胞桿菌抑制區(qū)的代表性明場圖像。紅色虛線圓圈表示對藥敏片的位置，黑色虛線圓圈表示抑制區(qū)。（f）對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌或銅綠假單胞桿菌的抑制區(qū)的直徑。每個點(diǎn)代表平均值±SD（n = 3），***P < 0.001。ns 表示無顯著性差異。

圖5. 5% GL MN貼片體外的生物膜清除效果。（a）金黃色葡萄球菌接受不同治療后的共聚焦激光掃描顯微鏡圖像。綠色：活細(xì)菌。（b）不同微針處理后用結(jié)晶紫染色的生物膜圖像。（c）金黃色葡萄球菌在（a）中接受不同處理后的生物膜清除率。（d）金黃色葡萄球菌在（b）中用不同微針處理后的生物膜清除率。每個點(diǎn)表示的平均值±SD（n = 3）。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。ns 表示無顯著性差異。

緊接著，通過流式細(xì)胞術(shù)、實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）、蛋白質(zhì)印跡（WB）驗(yàn)證了基于羅伊氏乳桿菌GL MNs貼片的抗炎作用。

圖6. 體外GL MNs貼片的抗炎特性。（a）流式細(xì)胞術(shù)分析不同組的RAW 264.7的細(xì)胞內(nèi)CD86的熒光強(qiáng)度。（b）不同組的流式細(xì)胞術(shù)直方圖。（c）不同組的CD86相對表達(dá)水平。（d-e）不同處理后通過qPCR測定RAW 264.7細(xì)胞中IL-6和TNF-α的表達(dá)水平。（f-h）不同處理后通過蛋白質(zhì)印跡法測定RAW 264.7細(xì)胞中IL-6和TNF-α的表達(dá)水平。每個點(diǎn)表示平均值±SD（n = 3），*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。

基于GL MNs貼片的形態(tài)、皮膚穿透能力、機(jī)械強(qiáng)度、溶解速度和抗菌功效等方面的表征，確定5 % GL MN是遞送羅伊氏乳桿菌到傷口處進(jìn)行抗菌的最佳方案。之后，細(xì)胞活死染色實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)證明了5% GL MN貼片在體外具有優(yōu)異的生物相容性。羅伊氏乳桿菌在5% GL MN貼片中的穩(wěn)定性對于維持其抗菌活性至關(guān)重要，將5% GL MN貼片在4℃和25℃下分別保存，羅伊氏乳桿菌在室溫下可在5% GL MN貼片中存活7天，超過40%的活菌保留在貼片中；將貼片置于4℃時，羅伊氏乳桿菌在60天后仍保持高活力（>80%），這表明羅伊氏乳桿菌在5% GL MN貼片中具有長期穩(wěn)定性。

圖7. 5% GL MN貼片的細(xì)胞毒性和穩(wěn)定性。（a）接受不同處理后NIH-3T3細(xì)胞的活/死測定。（b） 接受不同處理后 NIH-3T3 細(xì)胞和 HUVEC 細(xì)胞的活力分析。MRS瓊脂平板的明場圖像顯示0%和5% GL MN貼片中羅伊氏乳桿菌在25℃（c）或4℃（e）下儲存時細(xì)菌活力隨時間變化情況。在25℃（d）或4℃（f）下儲存不同時間后，0%和5% GL MN貼片中羅伊氏乳桿菌的菌落計(jì)數(shù)。每個點(diǎn)表示平均值±SD（n = 3）。

然后，在小鼠身上建立全層皮膚傷口模型，將5% GL MN貼片施用于傷口處，可以看到5% GL MN貼片可以促進(jìn)傷口的愈合，并且對傷口處的金黃色葡萄球菌有持續(xù)的抑制作用。

圖8. 5% GL MN貼片在體內(nèi)的抗菌作用。（a）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的時間方案。（b）小鼠接受不同治療后第0、3、5、7、9天皮膚傷口的代表性圖片。黑色虛線圓圈表示原始傷口區(qū)域（直徑：1厘米）。（c）9天內(nèi)不同組的傷口形態(tài)變化示意圖。（d）不同組在第 0、3、5、7和9天從傷口組織中分離出的金黃色葡萄球菌菌落的代表性圖像。（e）不同處理的小鼠皮膚傷口剩余面積比例-時間曲線。（f）不同組在第 0、3、5、7 和9天從傷口組織中分離的金黃色葡萄球菌菌落計(jì)數(shù)。（g）小鼠接受不同治療后的體重變化。每個點(diǎn)表示平均值±SD（n = 7），*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。ns表示無顯著性差異。

最后，對小鼠傷口處皮膚進(jìn)行病理學(xué)切片染色，H&E、Masson、IL-6、CD31染色表明，5% GL MN貼片具有良好的促進(jìn)傷口愈合、減少炎癥反應(yīng)、促進(jìn)血管生成的作用。

圖9. 不同治療后的組織再生、炎癥反應(yīng)和血管生成。第9天不同處理后（a）H&E染色（b）Masson染色和（c）IL-6免疫組化染色的代表性明場顯微圖像。（a）中的藍(lán)色箭頭表示傷口長度，黑色箭頭表示傷口厚度。（d）在第9天不同治療后用CD31（紅色）和DAPI（藍(lán)色）染色后傷口組織新生血管形成的免疫熒光圖像。第9天不同治療組的H&E染色顯示的傷口長度（e）和傷口厚度（f）分析。（g）第9天不同治療組的膠原蛋白體積分?jǐn)?shù)（CVF）。（h）在第9天不同治療組IL-6的陽性細(xì)胞數(shù)。（i）第9天不同治療的CD31陽性細(xì)胞數(shù)。每個點(diǎn)表示平均值±SD（n = 7），*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。

結(jié)論：綜上，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種新型且生物相容性良好的益生菌微針貼片，具有長效抗菌作用，可促進(jìn)感染傷口的愈合。微針貼片為益生菌提供了良好的保護(hù)，在4℃下，它在微針貼片內(nèi)保持高達(dá)80%的活力超過60天。插入皮膚后，微針貼片迅速溶解并實(shí)現(xiàn)益生菌在深層傷口組織中的快速遞送，益生菌能夠在傷口中存活約一周，并不斷將共同遞送的甘油轉(zhuǎn)化為抗菌物質(zhì)，從而在感染的傷口中實(shí)現(xiàn)長效抗菌作用。在金黃色葡萄球菌感染傷口的小鼠模型中，與對照組相比，一次施用益生菌微針貼劑在消除有害細(xì)菌和促進(jìn)傷口閉合方面表現(xiàn)出更好的效果，同時減少炎癥、增強(qiáng)組織再生和血管生成，這對慢性感染傷口的治療具有巨大潛力。