增材制造，通常被稱為3D打印，在組織工程領(lǐng)域因其能夠制造具有復(fù)雜三維和可定制幾何形狀的合成生物相容性支架而受到了顯著關(guān)注。這些支架能夠有效地支持細(xì)胞生長和組織形成，其中材料擠出、材料噴射和槽式光聚合在內(nèi)的3D打印技術(shù)已被用于支架的制造。目前，生物打印技術(shù)可以直接3D打印細(xì)胞，這些細(xì)胞被嵌入水凝膠墨水中，能同時(shí)保持與解剖結(jié)構(gòu)相似的空間布局。盡管增材制造在支架制造方面取得了快速進(jìn)展，但仍存在一些挑戰(zhàn)。尤其是在單個(gè)制造模式中實(shí)現(xiàn)部件大小、打印分辨率、尺寸范圍、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和生物相容性之間的平衡仍然難以實(shí)現(xiàn)。例如，常用的基于注射器的制造方法（如熔融沉積建模和3D生物打印）在制造精度和分辨率方面仍不及其他增材制造技術(shù)。雙光子聚合在制造精度和分辨率上達(dá)到了很高的水平，使得細(xì)胞水平上的支架交互成為可能，但它仍面臨制造效率和構(gòu)建體積的限制，通常構(gòu)建體積小于1 mm3。相比之下，立體光刻和槽式聚合技術(shù)在擴(kuò)大制造規(guī)模、提高精度和分辨率方面展現(xiàn)出潛力，但它們所采用的光固化環(huán)氧樹脂作為打印材料，往往對(duì)細(xì)胞的生物相容性和毒性等方面都表現(xiàn)不佳。

碳，在生物材料支架和生物制造領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的潛力，這得益于其出色的生物相容性、化學(xué)穩(wěn)定性以及可調(diào)節(jié)的機(jī)械和電氣特性。在不同的碳同素異形體中，碳納米管（CNTs）和石墨烯已經(jīng)成為了非聚合物組織工程支架材料中的熱門選擇，這些材料中還展示了骨骼肌細(xì)胞的培養(yǎng)的可能性。然而，由于CNTs和石墨烯的納米材料性質(zhì)，這些材料不能直接進(jìn)行增材制造。傳統(tǒng)的3D碳材料結(jié)構(gòu)化方法涉及使用基于模板的方法，可在3D多孔模板上生長或沉積碳納米材料，然后通過腐蝕去除模板材料。這種方法的缺點(diǎn)是3D碳材料的形狀受到支架材料特性的限制。作為替代方案，CNTs和石墨烯可以被整合到聚合物基質(zhì)中以促進(jìn)直接3D打印。然而，聚合物復(fù)合材料可能會(huì)損害原始石墨烯或CNTs的固有生物響應(yīng)。

此外，將石墨烯或CNTs整合到聚合物基質(zhì)中主要應(yīng)用于基于擠出的3D打印，如前所述，這種方法在打印精度和分辨率方面存在不足，通常限制了細(xì)胞3D定殖。為了實(shí)現(xiàn)與所需組織工程應(yīng)用相匹配的結(jié)構(gòu)分辨率的3D打印純碳，結(jié)構(gòu)化聚合物前體的熱解提供了一種可行的解決方案。通過結(jié)合不同的增材制造過程和后續(xù)的熱解過程，已經(jīng)證明在不同的長度尺度上可以實(shí)現(xiàn)3D結(jié)構(gòu)化熱解碳（PyC）的可行性。例如，雙光子聚合可以制造出具有分辨率高達(dá)數(shù)百納米的3D結(jié)構(gòu)的PyC。相比之下，立體光刻3D打印的結(jié)構(gòu)尺寸可以從亞100微米到幾毫米。然而，將3D結(jié)構(gòu)的PyC作為細(xì)胞3D生長支架的應(yīng)用仍未被探索。一些研究表明，在骨骼組織工程中使用3D結(jié)構(gòu)的PyC結(jié)構(gòu)具有前景。然而，這些研究中的孔隙大小（>300 μm）在元素之間顯著較大，仍然限制了實(shí)現(xiàn)細(xì)胞3D定殖。

基于此，來自海德堡大學(xué)的研發(fā)團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種可變形3D結(jié)構(gòu)的PyC作為潛在的生物材料支架，并研究了它們與骨骼肌細(xì)胞的相互作用，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的三維培養(yǎng)。該研究以“Microarchitected Compliant Scaffolds of Pyrolytic Carbon for 3D Muscle Cell Growth"發(fā)布在國際期刊《Advanced Healthcare Materials》。

在本研究中，團(tuán)隊(duì)使用摩方精密面投影微立體光刻（PμSL）3D打印技術(shù)（nanoArch® S130，精度：2 μm）制備出主要結(jié)構(gòu)，隨后通過熱解實(shí)現(xiàn)了具有與骨骼肌細(xì)胞相當(dāng)可變形PyC支架的尺寸特征。盡管在組織工程應(yīng)用中通常使用固定的剛性支架，該研究團(tuán)隊(duì)還將開發(fā)一種新穎的概念，用于制造可變形的PyC支架。在這里，“形狀變形"指的是結(jié)構(gòu)通過機(jī)械或手動(dòng)操作改變其空間排列的能力。需要注意的是，PyC本質(zhì)上具有脆性，限制了其自然形狀變形的潛力。為了克服這一挑戰(zhàn)，團(tuán)隊(duì)采用了基于可變形機(jī)制設(shè)計(jì)的方法，以實(shí)現(xiàn)PyC結(jié)構(gòu)的可變形能力。

PyC結(jié)構(gòu)熱解過程由于前驅(qū)體樹脂的熱化學(xué)分解釋放氣態(tài)化合物而導(dǎo)致顯著的幾何收縮。這種收縮使得PyC晶格厚度可以明顯小于制造能力，例如，設(shè)計(jì)晶格厚度為15微米的結(jié)構(gòu)在熱解后PyC晶格厚度為4.1 ± 0.4 μm。收縮程度取決于前驅(qū)體的晶格厚度和熱解溫度。氣態(tài)副產(chǎn)物的釋放通過從表面排氣，因此，較高的表面積導(dǎo)致較高的排氣程度。較小的晶格厚度提供了較高的表面積與體積比，導(dǎo)致較高的收縮程度，例如，當(dāng)最終熱解溫度為900°C，設(shè)計(jì)晶格厚度從15到150 μm的收縮率為73 ± 3%到60 ± 2%。另一方面，將熱解溫度從500°C增加到900°C，對(duì)于150 μm的晶格厚度，收縮程度從50 ± 3%增加到60 ± 2%。收縮的溫度依賴性主要?dú)w因于溫度范圍內(nèi)的質(zhì)量損失。

熱解碳本質(zhì)上是剛性和脆性的。由于其固有的剛性，改變PyC材料的幾何形狀具有挑戰(zhàn)性，幾乎是不可能的。為了解決這一挑戰(zhàn)，團(tuán)隊(duì)采用了基于可變形機(jī)制設(shè)計(jì)的方法。設(shè)計(jì)了具有鉸鏈的幾何結(jié)構(gòu)，其中單元通過涉及環(huán)形環(huán)和軸的控制間隙的旋轉(zhuǎn)關(guān)節(jié)連接，從而具有可變形特性，并通過這些旋轉(zhuǎn)關(guān)節(jié)實(shí)現(xiàn)形狀變化的能力。

然后，研究團(tuán)隊(duì)在3D打印熱解后的PyC支架中培養(yǎng)了C2C12細(xì)胞，以評(píng)估其生物相容性和細(xì)胞生長的能力。C2C12細(xì)胞通常被用作肌肉研究的模型細(xì)胞，因?yàn)樗鼈兙哂袉魏撕退笮蔚某杉〖?xì)胞，這些細(xì)胞后來分化為多核的肌管，模仿體內(nèi)肌肉纖維的形成過程。通過甲基噻唑藍(lán)溴化物（MTT）代謝活性和細(xì)胞間接接觸PyC材料的活死染色，團(tuán)隊(duì)檢查了PyC支架的生物相容性，圖5b顯示了500°C、700°C和900°C的PyC結(jié)構(gòu)使用MTT試驗(yàn)的結(jié)果，表明所有結(jié)構(gòu)都是生物相容的。團(tuán)隊(duì)還對(duì)骨骼肌細(xì)胞間接接觸結(jié)構(gòu)進(jìn)行了活死染色，以進(jìn)一步研究PyC材料的生物相容性。用鈣黃綠素/碘化丙啶染色后，測(cè)量了活細(xì)胞與死細(xì)胞的比率，并繪制在圖5a中，用于不同熱解溫度獲得的PyC支架，在結(jié)構(gòu)上并沒有看到對(duì)肌肉細(xì)胞的毒性跡象。

肌動(dòng)蛋白纖維顯著影響細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)動(dòng)能力、細(xì)胞附著和機(jī)械性能。因此，團(tuán)隊(duì)研究了C2C12細(xì)胞在碳格上的細(xì)胞骨架排列。圖5c–h中phalloidin的熒光圖像揭示了細(xì)胞骨架中密集的絲狀肌動(dòng)蛋白束。細(xì)胞主要覆蓋了結(jié)構(gòu)的邊緣。培養(yǎng)的細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白纖維似乎在細(xì)胞骨架中隨機(jī)分布。有趣的是，經(jīng)過七天的培養(yǎng)，孔隙中至少填充了43 μm深的骨骼肌細(xì)胞，這表明實(shí)現(xiàn)了3D定殖，這對(duì)于許多組織工程應(yīng)用是至關(guān)重要的。細(xì)胞3D定殖進(jìn)一步通過SEM調(diào)查得到證實(shí)。圖5i–k展示了經(jīng)過22天細(xì)胞培養(yǎng)的生物混合構(gòu)建的SEM圖像。細(xì)胞覆蓋了PyC支架，并表現(xiàn)出延長的形態(tài)，這表明細(xì)胞在PyC表面上的優(yōu)先生長。此外，觀察到細(xì)胞在孔隙中生長，并在孔隙上橋接，表明PyC支架支持3D骨骼肌細(xì)胞生長。

骨骼肌細(xì)胞支架的關(guān)鍵標(biāo)準(zhǔn)之一是它們誘導(dǎo)成肌管形成的能力，成肌管是由成肌母細(xì)胞融合產(chǎn)生的多核纖維結(jié)構(gòu)。 因此，團(tuán)隊(duì)通過分析Hoechst和phalloidin染色的細(xì)胞核和肌動(dòng)蛋白纖維的熒光，研究了PyC支架誘導(dǎo)成肌管形成的能力。圖6展示了在不同熱解溫度下制備的PyC支架上形成非常少的成肌管。此外，團(tuán)隊(duì)還在PyC支架上進(jìn)行了熒光研究，以研究形成的肌動(dòng)蛋白。這些結(jié)果表明，在不同溫度下PyC支架上都形成了成肌管，并且它們?cè)谥Ъ鼙砻婧芎玫匕l(fā)育并隨機(jī)定向。

在3D支架中，細(xì)胞遷移和增殖，向內(nèi)延伸以最終封閉或橋接孔隙，形成類似組織的片狀結(jié)構(gòu)。細(xì)胞的集體行為，包括在3D結(jié)構(gòu)中傳播時(shí)的速度和最終形狀的橋，取決于孔隙的幾何形狀和大小。例如，在發(fā)展的界面上細(xì)胞擁擠或展開取決于初始基質(zhì)是凹的還是凸的。為了更廣泛地探索C2C12細(xì)胞與可變形的PyC結(jié)構(gòu)之間的相互作用，細(xì)胞被培養(yǎng)在PyC鏈結(jié)構(gòu)上，這些結(jié)構(gòu)為3D細(xì)胞生長提供了各種幾何形狀。通過實(shí)驗(yàn)可以看到，細(xì)胞覆蓋了整個(gè)鏈結(jié)構(gòu)，包括格構(gòu)件之間的間隙甚至旋轉(zhuǎn)關(guān)節(jié)內(nèi)。細(xì)胞被觀察到以平坦的片狀而不是聚集體的方式排列，在這些片狀中形成了多個(gè)細(xì)胞層。隨后，它們利用細(xì)胞間連接橋接孔隙，跨越相當(dāng)大的距離并有效地填充孔隙。

綜上，研究團(tuán)隊(duì)展示了微型結(jié)構(gòu)熱解后的碳結(jié)構(gòu)用于骨骼肌細(xì)胞的3D細(xì)胞生長。團(tuán)隊(duì)通過利用摩方精密PμSL技術(shù)制造樹脂微型結(jié)構(gòu)，然后進(jìn)行熱解得到3D結(jié)構(gòu)的PyC。除了典型的固定和剛性的3D結(jié)構(gòu)的PyC外，團(tuán)隊(duì)還采用了一種新的設(shè)計(jì)方法制造了新的可變形3D結(jié)構(gòu)的Pyc。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，C2C12骨骼肌細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)PyC材料的強(qiáng)烈親和力，顯示出良好的生物相容性和細(xì)胞增殖。細(xì)胞在剛性和可變形的PyC支架中定殖，行成真正的3D細(xì)胞定殖。3D結(jié)構(gòu)的PyC進(jìn)一步導(dǎo)致培養(yǎng)的肌肉細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白纖維沿可變形結(jié)構(gòu)的良好排列。在PyC結(jié)構(gòu)表面也形成了大量成肌管，其形成依賴于與熱解溫度相關(guān)的PyC剛度。然而，PyC材料的成肌分化能力在這里并未全部實(shí)現(xiàn)，這需要進(jìn)一步的廣泛研究。

本研究的結(jié)果對(duì)于利用3D打印的熱解碳結(jié)構(gòu)作為細(xì)胞支架具有重要意義，3D結(jié)構(gòu)的PyC對(duì)細(xì)胞的親和力可能為多功能支架的設(shè)計(jì)提供新的視角。